【ZiDongHua 之創(chuàng)新自科文收錄關(guān)鍵詞： 清華大學(xué) 自動(dòng)化系 顯微鏡  人工智能】

　　

　　紫冬學(xué)術(shù) | 戴瓊海/吳嘉敏/俞立團(tuán)隊(duì)發(fā)布共聚焦掃描光場(chǎng)顯微鏡：活體長(zhǎng)時(shí)程高速三維高分辨觀測(cè)新利器

　　

　　越來越多的研究發(fā)現(xiàn)體外與活體環(huán)境間的巨大差異會(huì)顯著影響細(xì)胞的功能與表型。大量生理與病理狀態(tài)下不同類型細(xì)胞間的交互作用難以在體外復(fù)現(xiàn)。因此，在哺乳動(dòng)物活體原位對(duì)細(xì)胞及亞細(xì)胞的高速變化進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)程觀測(cè)變得尤為重要。然而，目前常用的活體顯微成像技術(shù)如轉(zhuǎn)盤共焦顯微鏡（spinning disk confocal microscope，SDCM）和雙光子顯微鏡（two-photon microscopy），雖然通過共聚焦探測(cè)和非線性激發(fā)的方式有效去除了背景熒光干擾，但仍然面臨三維成像速度慢，光毒性大，組織像差引起的分辨率低等重要問題，難以滿足日益增長(zhǎng)的活體觀測(cè)需求。清華大學(xué)團(tuán)隊(duì)于2021年提出掃描光場(chǎng)顯微鏡（scanning light-field microscopy, sLFM）（詳見BioArt報(bào)道：Cell突破｜戴瓊海團(tuán)隊(duì)以前所未有的時(shí)空分辨率進(jìn)行哺乳動(dòng)物活體長(zhǎng)時(shí)程觀測(cè)）【1】，能夠以相機(jī)幀率的超高速實(shí)現(xiàn)三維高分辨率觀測(cè)，并將光毒性降低了三個(gè)數(shù)量級(jí)，為活體多細(xì)胞間交互研究打開了大門，但在一些復(fù)雜組織和樣本中仍然面臨強(qiáng)背景熒光干擾，相比于共聚焦探測(cè)損失了成像對(duì)比度。

　　

　　針對(duì)這一難題，2024年5月27日，Nature Biotechnology雜志在線發(fā)表了清華大學(xué)戴瓊海、吳嘉敏、俞立與浙江荷湖科技有限公司合作完成的題為L(zhǎng)ong-term intravital subcellular imaging with confocal scanning light-field microscopy的研究論文【2】。團(tuán)隊(duì)歷經(jīng)三年多的技術(shù)攻關(guān)和落地轉(zhuǎn)化，在掃描光場(chǎng)顯微鏡的基礎(chǔ)上引入了線掃描共聚焦模塊，配合全新的三維重建算法，研制了新一代的共聚焦掃描光場(chǎng)顯微鏡（csLFM），兼具兩者的性能優(yōu)勢(shì)。csLFM擁有跟共聚焦顯微鏡一致的光學(xué)層析能力，即使在深層組織或密集標(biāo)記的熒光樣本中依然能保持高對(duì)比度，同時(shí)三維成像速度相比轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡SDCM提高了100倍，光毒性降低了130倍，打破了并行度與保真度間的矛盾。csLFM將替代傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡，為科學(xué)家在活體復(fù)雜環(huán)境中獲得更真實(shí)、可靠的細(xì)胞及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)間相互作用信息提供前所未有的研究工具，支撐腦科學(xué)、免疫學(xué)、病理學(xué)等基礎(chǔ)學(xué)科產(chǎn)生重大突破。

 

　　

　　團(tuán)隊(duì)前期開發(fā)的掃描光場(chǎng)顯微鏡已經(jīng)在高速亞細(xì)胞分辨率長(zhǎng)時(shí)程三維觀測(cè)上具備顯著優(yōu)勢(shì)，如何兼具光學(xué)層析能力是進(jìn)一步提高其在多樣性生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)應(yīng)用中保持穩(wěn)定魯棒的成像質(zhì)量和實(shí)用性的關(guān)鍵所在。如圖1所示，共聚焦掃描光場(chǎng)顯微鏡csLFM巧妙地通過軸向拓展的線掃照明與相機(jī)本身的滾動(dòng)快門將共聚焦策略整合到掃描光場(chǎng)顯微鏡sLFM中。由于掃描光場(chǎng)顯微鏡天然的三維感知能力，無需非常小的狹縫或者小孔去除背景熒光，軸向拓展的線掃照明能夠在不損失三維光效率和三維成像速度的前提下對(duì)有效三維成像范圍外的背景熒光進(jìn)行特異性的去除，將圖像的信背比 (signal-to-background ratio, SBR) 提升了12 dB，具備與共聚焦顯微鏡一致的光學(xué)層析能力，并在數(shù)字自適應(yīng)光學(xué)的支撐下在復(fù)雜環(huán)境中保持了近衍射極限的三維高分辨率，精確捕捉細(xì)胞器等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

　　

　

　　

　　脾臟在免疫功能方面扮演著重要角色，其含有大量的免疫細(xì)胞和多種免疫分子。但因組織密集、強(qiáng)背景熒光以及對(duì)光損傷的敏感性，脾臟中細(xì)胞和亞細(xì)胞水平的成像極具挑戰(zhàn)性。研究人員憑借csLFM出色的光學(xué)層析性能和極低的光毒性，在國際上首次實(shí)現(xiàn)了脾臟內(nèi)免疫微環(huán)境連續(xù)數(shù)小時(shí)的毫秒級(jí)高速三維高分辨率觀測(cè)，并精細(xì)刻畫了免疫系統(tǒng)在自然狀態(tài)下如何協(xié)同工作。研究人員意外地觀察到NK細(xì)胞通過收縮絲體與巨噬細(xì)胞粘附，并在巨噬細(xì)胞內(nèi)定向產(chǎn)生遷移體，該遷移體傳遞現(xiàn)象也是首次在除了中性粒細(xì)胞之外的其他免疫細(xì)胞中觀察到，提示遷移體傳遞可能是一種增強(qiáng)先天適應(yīng)性免疫監(jiān)視的信號(hào)協(xié)同機(jī)制。更進(jìn)一步地，csLFM作為一個(gè)通用的活體成像框架，在有效去除背景熒光及其帶來的光子噪聲后，能夠精細(xì)地分辨微小的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)。例如，尺寸僅為50-250nm的收縮絲體，其在小鼠體內(nèi)的生成過程清晰地被csLFM動(dòng)態(tài)呈現(xiàn)。

 

　　

　　圖2 | 活體小鼠脾臟體內(nèi)遷移體傳遞過程的高速高分辨高保真三維成像

　　

　　圖3 | 活體小鼠體內(nèi)收縮絲體（50-250nm）的三維快速生成過程監(jiān)控

　　

　　方向選擇性在視覺神經(jīng)編碼過程中起關(guān)鍵作用。研究人員利用csLFM記錄了動(dòng)態(tài)光柵刺激下小鼠初級(jí)視覺皮層多個(gè)神經(jīng)元的鈣活動(dòng)，來評(píng)估對(duì)視覺刺激有反應(yīng)的神經(jīng)元的調(diào)諧特性。盡管掃描光場(chǎng)顯微鏡相比于傳統(tǒng)寬場(chǎng)顯微鏡已經(jīng)顯著去除了背景信號(hào)的干擾，但仍然有一些弱信號(hào)被淹沒于巨大的背景信號(hào)中，特別在密集神經(jīng)元標(biāo)記的狀態(tài)下，共聚焦掃描光場(chǎng)顯微鏡極大地削弱了大腦組織散射和密集熒光標(biāo)記帶來的背景串?dāng)_。定量結(jié)果表明，csLFM在皮層200-300微米的深度中，獲得的神經(jīng)元方向選擇性指數(shù)（OSI）達(dá)52%，與雙光子顯微鏡的成像性能相媲美并具備更高的空間分辨率。csLFM有望廣泛應(yīng)用于腦科學(xué)研究中，研究神經(jīng)元與不同類型細(xì)胞間的動(dòng)態(tài)交互過程。

　

　　跨膜電壓指示劑可以對(duì)單個(gè)神經(jīng)元內(nèi)毫秒級(jí)響應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，為在體大范圍電生理記錄提供了可能。然而，該技術(shù)也對(duì)顯微成像技術(shù)也提出了巨大的挑戰(zhàn)。csLFM在國際上首次實(shí)現(xiàn)對(duì)一個(gè)清醒的果蠅大腦中幾乎所有的多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行大規(guī)模高保真信號(hào)記錄，成像深度達(dá)100微米，速度高達(dá)為150幀/秒。對(duì)比數(shù)據(jù)表明，csLFM識(shí)別的神經(jīng)尖峰數(shù)量比sLFM增加了近3倍和脈沖幅度增強(qiáng)了1.5倍。此外，csLFM還可以將sLFM中被背景淹沒的弱電壓信號(hào)高保真地識(shí)別出來。該方法有力推進(jìn)了電壓指示劑在神經(jīng)科學(xué)中的應(yīng)用，助力對(duì)神經(jīng)環(huán)路功能和機(jī)制的精細(xì)化認(rèn)識(shí)，對(duì)由神經(jīng)環(huán)路發(fā)育異常引起的相關(guān)疾病診斷和治療有重大意義。

 

　　據(jù)悉，該突破性技術(shù)已落地轉(zhuǎn)化為顯微儀器產(chǎn)品SLiM2000。這也是研究團(tuán)隊(duì)產(chǎn)學(xué)研同步推進(jìn)的首次嘗試，在原理技術(shù)發(fā)表的同時(shí)推出量產(chǎn)的商業(yè)化系統(tǒng)。為了彌合學(xué)術(shù)研究原理樣機(jī)與商用儀器之間的鴻溝，滿足基礎(chǔ)研究對(duì)先進(jìn)儀器的迫切需求，過去三年多的時(shí)間里，SLiM2000理論技術(shù)研究與工程化產(chǎn)品研發(fā)雙管齊下。SLiM2000儀器產(chǎn)品已于近日與學(xué)術(shù)論文同時(shí)正式發(fā)布（http://www.hehutek.com/cn/product/slim2000）。該產(chǎn)品在分辨率和光學(xué)層析性能與轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡保持一致的情況下，支持高達(dá)每秒150幀的亞細(xì)胞分辨率高保真三維成像，三維成像速度提升100倍以上。同時(shí)還配置有自動(dòng)化的電動(dòng)位移臺(tái)，搭配定制化的樣品適配器，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)自動(dòng)聚焦、自動(dòng)追焦、實(shí)時(shí)渲染，借助人工智能分析，以獲取更快的結(jié)果跟蹤和更為深入的數(shù)據(jù)分析，并能直接與團(tuán)隊(duì)前期開發(fā)的去噪軟件等兼容。助力高速神經(jīng)成像、免疫微環(huán)境觀測(cè)等大規(guī)?；铙w細(xì)胞間相互作用的研究。

 

　　清華大學(xué)自動(dòng)化系博士后盧志、博士生左思清、生命學(xué)院博士生史明慧為該論文的共同第一作者，清華大學(xué)自動(dòng)化系、北京信息科學(xué)與技術(shù)國家研究中心、腦與認(rèn)知科學(xué)研究院、清華-IDG/麥戈文腦科學(xué)研究院戴瓊海教授，吳嘉敏副教授，生命學(xué)院俞立教授為論文共同通訊作者。

　　

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　　參考文獻(xiàn)

　　

　　1. Wu, J. et al. Iterative tomography with digital adaptive optics permits hour-long intravital observation of 3D subcellular dynamics at millisecond scale. Cell 184, 3318-3332 (2021).

　　

　　2. Lu, Z. et al. Long-term intravital subcellular imaging with confocal scanning light-field microscopy. Nature Biotechnology (2024). https://doi.org/10.1038/s41587-024-02249-5