【ZiDongHua 之創(chuàng)新自科文收錄關鍵詞：共聚焦掃描光場顯微鏡 csLFM 三維成像 顯微儀器 】
　　
　　學術前沿丨戴瓊海/吳嘉敏/俞立團隊發(fā)布共聚焦掃描光場顯微鏡：活體長時程高速三維高分辨觀測新利器
　　
　　學會動態(tài)
　　
　　2024年5月27日，Nature Biotechnology雜志在線發(fā)表了由CAAI理事長、清華大學戴瓊海院士，以及清華大學吳嘉敏副教授、俞立教授與浙江荷湖科技有限公司合作完成的題為Long-term intravital subcellular imaging with confocal scanning light-field microscopy的研究論文。
　　
　　團隊歷經(jīng)三年多的技術攻關和落地轉(zhuǎn)化，研制了新一代的共聚焦掃描光場顯微鏡（csLFM），為科學家在活體復雜環(huán)境中獲得更真實、可靠的細胞及亞細胞結構間相互作用信息提供前所未有的研究工具，支撐腦科學、免疫學、病理學等基礎學科產(chǎn)生重大突破。
 
　　
　　轉(zhuǎn)自 BioArt
　　
　　越來越多的研究發(fā)現(xiàn)體外與活體環(huán)境間的巨大差異會顯著影響細胞的功能與表型。大量生理與病理狀態(tài)下不同類型細胞間的交互作用難以在體外復現(xiàn)。因此，在哺乳動物活體原位對細胞及亞細胞的高速變化進行長時程觀測變得尤為重要。然而，目前常用的活體顯微成像技術如轉(zhuǎn)盤共焦顯微鏡（spinning disk confocal microscope，SDCM）和雙光子顯微鏡（two-photon microscopy），雖然通過共聚焦探測和非線性激發(fā)的方式有效去除了背景熒光干擾，但仍然面臨三維成像速度慢，光毒性大，組織像差引起的分辨率低等重要問題，難以滿足日益增長的活體觀測需求。清華大學團隊于2021年提出掃描光場顯微鏡（scanning light-field microscopy, sLFM）（詳見BioArt報道：Cell突破｜戴瓊海團隊以前所未有的時空分辨率進行哺乳動物活體長時程觀測）【1】，能夠以相機幀率的超高速實現(xiàn)三維高分辨率觀測，并將光毒性降低了三個數(shù)量級，為活體多細胞間交互研究打開了大門，但在一些復雜組織和樣本中仍然面臨強背景熒光干擾，相比于共聚焦探測損失了成像對比度。
　　
　　針對這一難題，2024年5月27日，Nature Biotechnology雜志在線發(fā)表了清華大學戴瓊海、吳嘉敏、俞立與浙江荷湖科技有限公司合作完成的題為Long-term intravital subcellular imaging with confocal scanning light-field microscopy的研究論文【2】。團隊歷經(jīng)三年多的技術攻關和落地轉(zhuǎn)化，在掃描光場顯微鏡的基礎上引入了線掃描共聚焦模塊，配合全新的三維重建算法，研制了新一代的共聚焦掃描光場顯微鏡（csLFM），兼具兩者的性能優(yōu)勢。csLFM擁有跟共聚焦顯微鏡一致的光學層析能力，即使在深層組織或密集標記的熒光樣本中依然能保持高對比度，同時三維成像速度相比轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡SDCM提高了100倍，光毒性降低了130倍，打破了并行度與保真度間的矛盾。csLFM將替代傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡，為科學家在活體復雜環(huán)境中獲得更真實、可靠的細胞及亞細胞結構間相互作用信息提供前所未有的研究工具，支撐腦科學、免疫學、病理學等基礎學科產(chǎn)生重大突破。
　　
　　團隊前期開發(fā)的掃描光場顯微鏡已經(jīng)在高速亞細胞分辨率長時程三維觀測上具備顯著優(yōu)勢，如何兼具光學層析能力是進一步提高其在多樣性生命科學與醫(yī)學應用中保持穩(wěn)定魯棒的成像質(zhì)量和實用性的關鍵所在。如圖1所示，共聚焦掃描光場顯微鏡csLFM巧妙地通過軸向拓展的線掃照明與相機本身的滾動快門將共聚焦策略整合到掃描光場顯微鏡sLFM中。由于掃描光場顯微鏡天然的三維感知能力，無需非常小的狹縫或者小孔去除背景熒光，軸向拓展的線掃照明能夠在不損失三維光效率和三維成像速度的前提下對有效三維成像范圍外的背景熒光進行特異性的去除，將圖像的信背比 (signal-to-background ratio, SBR) 提升了12 dB，具備與共聚焦顯微鏡一致的光學層析能力，并在數(shù)字自適應光學的支撐下在復雜環(huán)境中保持了近衍射極限的三維高分辨率，精確捕捉細胞器等亞細胞結構。
 
　　
　　圖1 | 共聚焦掃描光場顯微鏡（csLFM）的原理示意圖
　　
　　脾臟在免疫功能方面扮演著重要角色，其含有大量的免疫細胞和多種免疫分子。但因組織密集、強背景熒光以及對光損傷的敏感性，脾臟中細胞和亞細胞水平的成像極具挑戰(zhàn)性。研究人員憑借csLFM出色的光學層析性能和極低的光毒性，在國際上首次實現(xiàn)了脾臟內(nèi)免疫微環(huán)境連續(xù)數(shù)小時的毫秒級高速三維高分辨率觀測，并精細刻畫了免疫系統(tǒng)在自然狀態(tài)下如何協(xié)同工作。研究人員意外地觀察到NK細胞通過收縮絲體與巨噬細胞粘附，并在巨噬細胞內(nèi)定向產(chǎn)生遷移體，該遷移體傳遞現(xiàn)象也是首次在除了中性粒細胞之外的其他免疫細胞中觀察到，提示遷移體傳遞可能是一種增強先天適應性免疫監(jiān)視的信號協(xié)同機制。更進一步地，csLFM作為一個通用的活體成像框架，在有效去除背景熒光及其帶來的光子噪聲后，能夠精細地分辨微小的細胞器結構。例如，尺寸僅為50-250nm的收縮絲體，其在小鼠體內(nèi)的生成過程清晰地被csLFM動態(tài)呈現(xiàn)。
 
　　
　　圖2 | 活體小鼠脾臟體內(nèi)遷移體傳遞過程的高速高分辨高保真三維成像
 
　　方向選擇性在視覺神經(jīng)編碼過程中起關鍵作用。研究人員利用csLFM記錄了動態(tài)光柵刺激下小鼠初級視覺皮層多個神經(jīng)元的鈣活動，來評估對視覺刺激有反應的神經(jīng)元的調(diào)諧特性。盡管掃描光場顯微鏡相比于傳統(tǒng)寬場顯微鏡已經(jīng)顯著去除了背景信號的干擾，但仍然有一些弱信號被淹沒于巨大的背景信號中，特別在密集神經(jīng)元標記的狀態(tài)下，共聚焦掃描光場顯微鏡極大地削弱了大腦組織散射和密集熒光標記帶來的背景串擾。定量結果表明，csLFM在皮層200-300微米的深度中，獲得的神經(jīng)元方向選擇性指數(shù)（OSI）達52%，與雙光子顯微鏡的成像性能相媲美并具備更高的空間分辨率。csLFM有望廣泛應用于腦科學研究中，研究神經(jīng)元與不同類型細胞間的動態(tài)交互過程。
　　
　　跨膜電壓指示劑可以對單個神經(jīng)元內(nèi)毫秒級響應進行檢測，為在體大范圍電生理記錄提供了可能。然而，該技術也對顯微成像技術也提出了巨大的挑戰(zhàn)。csLFM在國際上首次實現(xiàn)對一個清醒的果蠅大腦中幾乎所有的多巴胺能神經(jīng)元進行大規(guī)模高保真信號記錄，成像深度達100微米，速度高達為150幀/秒。對比數(shù)據(jù)表明，csLFM識別的神經(jīng)尖峰數(shù)量比sLFM增加了近3倍和脈沖幅度增強了1.5倍。此外，csLFM還可以將sLFM中被背景淹沒的弱電壓信號高保真地識別出來。該方法有力推進了電壓指示劑在神經(jīng)科學中的應用，助力對神經(jīng)環(huán)路功能和機制的精細化認識，對由神經(jīng)環(huán)路發(fā)育異常引起的相關疾病診斷和治療有重大意義。
 
　　據(jù)悉，該突破性技術已落地轉(zhuǎn)化為顯微儀器產(chǎn)品SLiM2000。這也是研究團隊產(chǎn)學研同步推進的首次嘗試，在原理技術發(fā)表的同時推出量產(chǎn)的商業(yè)化系統(tǒng)。為了彌合學術研究原理樣機與商用儀器之間的鴻溝，滿足基礎研究對先進儀器的迫切需求，過去三年多的時間里，SLiM2000理論技術研究與工程化產(chǎn)品研發(fā)雙管齊下。SLiM2000儀器產(chǎn)品已于近日與學術論文同時正式發(fā)布（http://www.hehutek.com/cn/product/slim2000）。該產(chǎn)品在分辨率和光學層析性能與轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡保持一致的情況下，支持高達每秒150幀的亞細胞分辨率高保真三維成像，三維成像速度提升100倍以上。同時還配置有自動化的電動位移臺，搭配定制化的樣品適配器，實現(xiàn)實時自動聚焦、自動追焦、實時渲染，借助人工智能分析，以獲取更快的結果跟蹤和更為深入的數(shù)據(jù)分析，并能直接與團隊前期開發(fā)的去噪軟件等兼容。助力高速神經(jīng)成像、免疫微環(huán)境觀測等大規(guī)模活體細胞間相互作用的研究。
　
　　清華大學自動化系博士后盧志、博士生左思清、生命學院博士生史明慧為該論文的共同第一作者，清華大學自動化系、北京信息科學與技術國家研究中心、腦與認知科學研究院、清華-IDG/麥戈文腦科學研究院戴瓊海教授，吳嘉敏副教授，生命學院俞立教授為論文共同通訊作者。
　　
　　原文鏈接：
　　
　　https://www.nature.com/articles/s41587-024-02249-5
　　
　　制版人：十一
　　
　　參考文獻
　　
　　1. Wu, J. et al. Iterative tomography with digital adaptive optics permits hour-long intravital observation of 3D subcellular dynamics at millisecond scale. Cell 184, 3318-3332 (2021).
　　
　　2. Lu, Z. et al. Long-term intravital subcellular imaging with confocal scanning light-field microscopy. Nature Biotechnology (2024). https://doi.org/10.1038/s41587-024-02249-5